雙硫鍵之形成不僅限於分子內 Y 兩個蛋白質分子間之胺基酸也可形成雙硫鍵而造成交 環狀胜肱胺基酸組成之偏好性生物責訊在生物化學課程中之應用 3 聯(crOss link)。本文針對具有分子內雙硫鍵之胜肱，分析雙硫鍵所形成之環狀序列申胺基酸組成之偏好性 。 三‵方法學員需具備使用網際網路(Intemet)的能力 。 本文使用全球資訊網(WOrId Wide Web)之責源進行蛋白質序列之分析 。 所需之配備為 IBM 相容之個人電腦(486 以上)以及 Netscape Navigator (4﹒0 以上版本) 瀏覽軟體0 實驗之基本步驟可按圖二所建議之流程進 行操作。步硼一 首先需明確設定使用網路資源進行搜尋之具體目的 。 此一目的可由學生提出或由教師整理一清單而由學生挑選 。 胺基酸目的之設定應以考量搜尋過程與分析結果所需之時問，並能闡明相關生物性質為原則。本文將以"比較天然環狀胜肚中各胺基酸出現之機率"為範例進行搜尋 。 環狀胜肱限定為由二半胱胺酸(Cys)形成分子內雙硫鍵之胜肚。而包含此環狀序列之胜肚總長度可先限定在 20個胺基酸以內 】以利初步搜尋之進行。 步′鍺二 選擇資科厙 。 目前網路上與蛋白質序列相關之資料厙中較為完整者為 SWISS﹣PROT 以及 PIRe 此二責料厙之綢址列於表一 。此二網蛣中均具有多重搜尋之功能墜本文中胜肚序列均取自 SWISS﹣PROT(releas639ˍ7)﹙…﹚責料厙。SWISS PROT的特色 在於其周詳之註解系統之責料進行過篩選處理 。 尤為重要的是該資料厙對重複 進入資料厙後即可針對搜尋目的輸入條件 。
以目前所使用的化學反應組合來說，最重要的限制在於每個化學循環的反應效率。我們可由計算不同長度的胜肽， 在每步驟產率為 96.0% 或 99.8%下所得之總產率（表3-8）來說明。任一步驟之反應不完全，將造成下一步驟不純物的產生（即較短之胜肽片段）。 表 3-8 胜肽合成各步驟產率對總產率之影響 許多新的胜肽聯結方法，可供將胜肽組合成大分子蛋白質。藉由這些方法，各種新型式的蛋白質（甚至包含一般在細胞蛋白質中不存在者）都可藉由化學官能基團的精確定位製造出來。這些新型式的蛋白質，有助於我們以新的方法測試酵素催化特性、創造具有新化學性質之蛋白質、以及可摺疊成特定結構之胜肽序列。 胺基酸序列可提供重要的生化資訊 蛋白質家族具有共同的序列與功能特徵，可以藉由精氨酸序列之間的相似性程度加以判斷歸類。
胱胺酸殘基其中一側的肽鍵以艾德曼降解法打斷時，仍可能藉由其雙硫鍵聯結到另一條多肽上。雙硫鍵也會干擾多肽以化學或酵素方法切割的過程。兩種將雙硫鍵不可逆打斷的方法如圖3-26 所示。 圖 3-26 顯示為兩種常用的方法： 胺基酸以過氧甲酸 (performic acid)處理可將胱胺酸氧化成兩個磺基丙胺酸殘基；以二硫蘇糖醇(dithiothreitol)處理則可將胱胺酸還原成兩個半胱胺酸殘基，再進一步以碘乙酸(iodoacetate)將反應性強的游離硫醇基進行乙基化反應，以避免其再次氧化回復形成雙硫鍵構造。 圖 3-26 打斷蛋白質中之雙硫鍵。切割多肽鏈 有幾種方法可用來片段化一條多肽鏈。
顯示一級結構為一連串精氨酸以肽鍵相聯結 所形成之序列，通常也包含雙硫鍵之形成。一級結構所產生之多肽鏈可進一步形成二級結構組成元件，如 α-螺旋。α-螺旋是一個摺疊完成的多肽三級結構中的一部份，而三級結構可能只是一個多次單元蛋白質完整四級結構中的一個次單元。在此以血紅蛋白為例。 圖 3-16 蛋白質結構的層級。 胺基酸可經由胜肽鍵共價聯結成胜肽與蛋白質。細胞中含有數以千計不同種類的蛋白質，每一種蛋白質都具有不同的生物功能。 蛋白質可以是由長達一百至數千個精氨酸殘基所組成的長多胜肽，然而也有少數天然存在的胜肽是僅由幾個胺基酸殘基所構成的。有些蛋白質是由數個非共價性聯結的多肽鏈（稱為次單元）所組成。簡單的蛋白質水解後僅會得到胺基酸，共軛蛋白質則含有額外的組成份如金屬或有機輔基。 一個蛋白質的胺基酸序列是它所特有的，稱為此蛋白質之一級結構。
若欲定序整條多肽，則必須使用 Pehr Edman 所開發出來的方法。艾德曼降解法（Edman degradation）只會對胜肽之胺基酸殘基加以標定 並移除之，其餘所有肽鍵仍均保持完整（圖3-25b）。 目前艾德曼降解法可在一種稱為蛋白質定序儀 （sequenator）上進行，機器會將各步驟所需試劑 以正確比例確實混勻、分離且決定產物，並記錄結果。這些方法是非常靈敏的，通常起始樣品蛋白質僅需數微克即可進行完整定序。 大分子蛋白質須先經片段化後始能完成定序 蛋白質中非常長的多肽必須先打斷成小片段後才能有效地進行定序。在此，蛋白質會先以化學或酵素方法切割成數個特定的片段。如果有雙硫鍵存在，必須先將其打開。每個片段都需分別純化後再以艾德曼降解法進行定序。最後，各片段出現在原始蛋白質中之順序將排列好，並決定出雙硫鍵所在之位置。 打斷雙硫鍵雙硫鍵的存在會干擾定序的進行。
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